Übersetzung des Berichts von John Harbo.
Journal of Apicultural Research and Bee World 48(3): 156-161 (2009) © IBRA 2009
DOI 10.3896/IBRA.1.48.3.02
Übersetzt mit der Mithilfe von dietrued aus dem Arbeitskreis ResistantBees 
Reaktion der Bienen auf Varroen mit verschiedenen Stufen der Varroa Sensitive Hygiene
Zusammenfassung:
Milbenresistenz, welche wir früher als Unterdrückung der 
Milbenreproduktion (SMR) bezeichnet haben ist eine Form des hygienischen Verhaltens, das wir Varroa Sensitive Hygiene (VSH) genannt haben.
Bei der VSH unterbrechen erwachsene Arbeitsbienen die Vermehrung der Milben, indem sie infizierte Puppen aus den Zellen ausräumen. Diese Studie untersucht welche Brutzellen die Bienen erkennen und welche nicht und beschreibt den Zusammenhang zwischen Brutentfernung und dem Anreichern von sterilen Milben. Wir haben 26 Völker mit unterschiedlichen VSH Levels erzeugt, indem wir 14 Königinnen einer hohen VSH Linie H (100%), mit 12 Königinnen einer niederen Linie L (0% Varroaresistenz) mit Drohnen einer HL Linie (H+L) gekreuzt haben. Weil jede Königin nur mit einem Drohn verpaart wurde (also künstlich), entstanden also alle Mischungen bezüglich des VSH Repräsentanz (0-100%). Um die Brut(Puppen)entnahme einzuschätzen, haben wir die Milbenpopulation in sehr frisch verdeckelten Zellen (0-3T) gemessen und 7 Tage später nochmals, wenn die Testgruppe älter war (7-10Tage nach Verdeckeln). Wir haben die Brutentfernung der mit Milben infizierten Zellen mit drei Klassen von Elternmilbe verglichen: 1) lebensfähig: Elternmilbe mit weiblichen Nachwuchs der wieder eiablagefähig ist 2) nicht lebensfähig: Elternmilbe mit Nachwuchs, der aber nicht eiablagefähig (also z.B. unbefruchtetes Milbenweibchen oder gar nur männl. Milbe) ist. 3) keine Eier, Milben die entweder tot waren oder keine Eier legen konnten. Sobald die Brutentnahme durch die Bienen anstieg, verkleinerte sich der Anteil der Klassen 1) und 2), wobei die 3. Klasse konstant blieb. Deswegen muß das Eierablegen der Milbe oder etwas, was mit dem Eierablegen zusammenhängt, die Bienen stimulieren, die infizierten Zellen auszuräumen.
Einleitung:
Wir wählten Bienen aus nach Resistenz auf Varroa destructor Anderson and Trueman. Dank künstlicher Befruchtung mit einzelnen Drohnen erreichten wir schnell Resistenz (bis fast zur gänzlichen Elimination der Milben Population) Wir nannten diese Charateristik Unterdrückte Milben Reproduktion (Suppressed Mite Reproduction SMR), denn als wir Arbeiterbienenpuppen mit 7 bis 11 Tagen nach dem Verdeckeln untersuchten hatten fast alle keine lebensfähigen Nachkommen.(Harbo and Harris, 1999).
Studien haben gezeigt dass dieser Zustand verursacht wurde durch das Ausräumen von infizierter Brut durch die erwachsenen Bienen (Ibrahim und Spivak, 2004, 2006; Harbo und Harris, 2005). Dieses Ausräumen der von Milben infizierten Bienenpuppen ist offensichtlich auf die Arbeiterinnenbrut beschränkt, jedoch manchmal können Bienen auch infizierte Drohnenpuppen entfernen, aber sie reduzieren nicht signifikant den Befall in der Drohnenbrut (Harris, 2008).
Die Entfernung infizierter Puppen durch erwachsene Bienen erklärt, warum Milbenresistenz nicht vor Ablauf von 6 Wochen nach Einführung einer milbenresistenten Königin beobachtet warden konnte, warum die Milben dann so plötzlich verschwanden und wie die Milbenpopulation sich nach Einführung einer nichtresistenten Königin wieder erholte (Harbo und Harris, 1999; Harris und Harbo, 2000). Deswegen haben wir diese Milbenresistenzeigenschaft in Varroa Sensitive Hygiene oder VSH umbenannt, weil es als eine Form des hygienischen Verhaltens auftrat. Der Begriff SMR, anfangs nützlich in der Beschreibung unserer Zuchtarbeit, beschreibt nun nicht mehr präzise das Verhalten der resistenten Bienen.
Honigbienen zerstören manchmal ihre Brut, um (so wie es uns scheint) Krankheiten oder Parasiten oder einfach tote Brut zu eliminieren. Die Entnahme von Bienenpuppen, die mit Varroa infiziert sind, könnte also der Brutentnahme von AFB (Woodrow….) infizierter Zellen, vergleichbar sein. Rothenbuhler beschrieb diese Entnahme der befallenen Brut als hygienisches Verhalten und diese Bezeichnung wurde seitdem ausgeweitet auf das Entfernen von durch Unterkühlung gestorbener Brut (Newton), Brut getötet durch Punktierung (Spivak) , mit Kalkbrut infizierte Zellen (Gilliam), durch die große Wachsmotte befallene Brut (Correa_Marques…) oder Brut, die durch den kleinen Beutenkäfer – Aethina tumida – (Ellis et al….) befallen wurde. Deswegen, Hygiene bei Bienen bedeutet das Aufspüren und Entfernen der befallenen oder toten Brut durch erwachsene Bienen.
Diese unterschiedlichen Typen hygienischen Verhaltens haben Ähnlichkeiten aber auch Unterschiede. Spivak und Reuter (2001) fanden heraus, das Kolonien, die auf schnelle Entnahme gefriergetöteter Brut gezüchtet worden waren, auch resistenter gegen AFB waren. Studien die hohe und geringe Level von gefriergetöteter Brut und Kalkbrut untersuchten, fanden keine klaren Zusammenhänge (Taber…), aber eine Gruppe von Völkern die auf Entfernung gefriergetöteter Brut gezüchtet war, war auch insgesamt mehr resistent gegen Kalkbrut verglichen mit einer anderen Gruppe, die nur mäßige Eigenschaften gegen die Entfernung gefriergetrockneter Brut zeigte (Spivak….). Ähnlich dem, hat auch VSH Gemeinsamkeiten und Unterschiede mit den anderen Formen hygienischen Verhaltens. Zum Beispiel, VSH produziert intermediäre Phänotypen (unterschiedliche Ausprägungen), das am besten mit additiven Allelen (Harbo and Harris..) erklärt werden kann, wogegen das hygienische Verhalten gegen AFB (Rothenbuhler) ein rezessives Phänomen ist (das Merkmal muß reinerbig vorliegen, um in Erscheinung zu treten). Hygienisches Entfernen von gefriergetöteter Brut scheint durch quantitative Effekte mehrerer Gene kontrolliert zu sein (Lapidge).
Der Zweck dieses Papers ist daher eine präzise Beschreibung von VSH. VSH hat 2 generelle Elemente: Die Entnahme infizierter Brut und eine höhere Rate nicht reproduzierender Milben. In früheren Studien (Harbo) wurde gezeigt, das das stäkere Auftreten von nichtreproduzierenden Milben korreliert war mit einer Abnahme der Milbenpopulation, wogegen dies bei gefriergetöteter Brut nicht so war. Das Auftreten von nichtreproduzierenden Milben, war daher unser Zuchtmerkmal. Wir wissen nicht, ob die Anreicherung nichtreproduzierender Milben eine kritische Komponente der Milbenresistenz ist, aber sie ist zumindestens charakteristisch für VSH. Ein klare Beschreibung von VSH sollte andere befähigen: 1) diese Eigenschaft nachzustellen 2) Varianten oder Komponenten von VSH zu beschreiben und 3) Milbenresistenzmechanismen aufzudecken, die nicht oder teilweise mit VSH zusammenhängen. Spezifische Ziele dieser Arbeit waren: 1) welche Milbeninfektionen werden von VSH erkannt, 2) den Zusammenhang zwischen Brutentnahme und dem relativen Auftreten von nicht eierlegenden Milben beschreiben und 3) Milbenresistenzen zu beschreiben, die weniger als 100% der Allele von VSH haben.
Material und Methoden
Wir stellten 26 Kolonien her, die alle unterschiedlichen Expressionslevel von VSH Genen darstellen. 14 Kolonien hatten Königinnen aus einer 100% VSH Linie (high Linie – H) und 12 hatten Königinnen aus einer Linie, die kein VSH exprimiert (low Linie – L). Jede der 26 Königinnen würde zurückgekreuzt mit einem einzelnen Drohn aus einer HL Linie (Tochter aus beiden Linien H und L). Weil alle Spermazellen eines haploiden Drohn genetisch identisch sind (stammen aus einem haploiden Ei, dem Ursprung des Drohns), präsentieren die 26 Drohnen zufällig getrennte Gameten (Keimzellen) dieser Königin. Die ausgewählten Drohnen sollten daher zwischen 0-100% der Allele für VSH haben und die verschiedenen Varianten sollten außerdem gleichverteilt sein. Mit diesem Design sollten Stöcke aus der H Gruppe 50-100% der VSH Allele und die der Gruppe L 0-50% VSH Allele besitzen.
Die Testköniginnen wurden in die Stöcke Ende Juli bzw. Anfang August eingeweiselt. Die Brutentnahme der Stöcke (hyg. Verhalten) wurde, mindestens 6 Monate nachdem die Königin begonnen hat Eier zu legen, bewertet. Dadurch waren alle Arbeitsbienen im Alter von 0-3 Wochen Töchter der neuen Königin.
Milben Populationen in frisch verdeckelter Brut
Unsere erste Maßnahme war, die Milbenpopulation in frisch verdeckelter Brut zu bestimmen, damit wir die Brutentnahmerate bestimmen konnten. Wir nahmen Arbeiterinnenbrut, die gerade verdeckelt war (0-3 Tage), um den Referenzwert der Milbenpopulation in jedem Stock zu bestimmen. Frische Brut (Larve, Prepuppe) hat noch keine Häutung durchlaufen und demzufolge keine Haut der Larve in der Brutzelle.
Da in der Zeit von 0-3 Tagen die meisten Milben noch keine Eier gelegt haben, kann man in dieser Gruppe nur die Milbeninfektionsrate bestimmen. Dieselbe Brutwabe wurde 7 Tage später erneut, für die Bestimmung der Infektionsrate, aber auch für den Reproduktionserfolg der übriggebliebenen Milben, herangezogen.
Falls weniger als 5% neu verdeckelter Brut infiziert waren, wurden weitere Milben dem Stock zugegeben. Wir bewerkstelligten dies, indem wir eine unverdeckelte Brutwabe kaum infizierter Brut in ein hochinfiziertes Volk für 3 Tage gaben. Wir haben die Milbeninfektion dieser Brutwabe noch dadurch erhöht, das wir die Königin des stark infizierten Volkes 2 Wochen vor Brutwabenzugabe gekäfigt hatten. Die Käfigung war sinnvoll weil: (1) Die Donorkolonie hatten dann keine Larven mehr, in die die Milben gehen konnten, (2) Die Donorkolonie hat ein hohes Level an phoretischen Milben, die potentiell infektionsfähig waren, (3) die gekäfigte Königin, konnte keine Eier in die Brutwabe des anderen Volkes legen (falls ein erneuter Test dieses Volkes später notwendig geworden wäre). Nach 3 Tagen wurden inokulierte Waben aus den Donorvölkern entnommen, die Milbenpopulation durch das Öffnen von 200 Brutzellen gemessen und die Brutwaben wieder in Ihre Ursprungsvölker zurückgegeben.
Messen der Brutentnahme
Mit diesem Paper nehmen wir Bezug auf die Messung der Brutentnahme. Wir bestimmten die Änderung der Milbeninfektionsrate und postulieren, das das Fehlen von befallenen Puppen (zu einem späteren Zeitpunkt) durch die Brutentnahme von erwachsenen Bienen verursacht wurde. Falls jemand herausfinden sollte, das die infizierte Brut durch eine andere Ursache verschwinden sollte, wäre die Analyse noch immer richtig, aber der Bezug auf Brutentnahme müßte geändert werden. Um die Brutentnahme zu messen, haben wir die Brutwaben 7-10 Tage nach der Verdecklung erneut einer Messung des Milbenbefalls unterzogen. Wir haben die Puppen diesen Alters durch deren Farbe identifiziert, violette Augen und weißer Körper – bis bräunlicher Körper. Wir haben die Infektionsrate der Zellen, die Anzahl des Milbennachwuchses und das Entwicklungsstadíum des Milbennachwuchses analysiert. Wir mußten 428 ± 180 (Durchschnitt ± STAW) Zellen pro Volk untersuchen, um im Durchschnitt auf 20 ± 8 infizierte Zellen von jedem der 26 Völker zu kommen. Eine Meßprobe bestand aus 200 Zellen (mehr für die 2. Probe, wie oben beschrieben). Für jede Probe wurde die Anzahl der infizierten und die nicht infizierten Zellen bestimmt. Wir nahmen die nicht infizierten Zellen als unseren Vergleich und errechneten einen Infektionswert (Anzahl der infizierten Zellen/100 nicht infizierter Zellen).
Getestete Hypothesen
Unser vorrangiges Ziel war es, zu untersuchen, welche mit Milben infizierte Zellen, durch VSH anvisiert wurden. Wir haben 4 Möglichkeiten untersucht:
1)Bienen entfernen Puppen zufällig, 2) Bienen entfernen alle infizierte Puppen gleichwertig, 3) Bienen entfernen alle mit Milben infizierte Puppen, die mind. einen lebenstüchtige weiblichen Nachkommen besitzen ( eine die ihre Entwicklung vor dem Öffnen der Biene abgeschlossen hat); 4) Bienen entfernen alle Puppen mit Milben, die Eier legen
Die 1. Hypothese wurde getestet, indem die Milbenentnahme aller Kolonien mit dem Programm Analysis of Variance 8SAS 2000) verglichen wurde. Die Analyse verglich die H und L Kolonien, um zu bestimmen, ob die Entnahme von infizierten Zellen unterschiedlich war und ob beide Gruppe signifikant unterschiedlich von 0 waren. Um auf Nichtnormalität der Verhältnisdaten abzugleichen, wurde jeder Prozentwert der Entnahme in den log10 der Entnahmerate +1 umgewandelt. Regressionsanalysen wurden genutzt, um die Hypothesen 2-4 zu überprüfen. Durch Begutachtung der 3 Milbennachwuchsgruppen (Milben mit überlebensfähigen Nachwuchs, Milben mit nicht überlebensfähigen Nachwuchs und Milben, die keine Eier legen) konnten wir bestimmen, ob das Überleben jeder Klasse durch Veränderungen in der Entnahmerate infizierte Zellen beeinflußt wurde.
Die Regressionsanalyse wurde auch genutzt, um das Verhältnis zwischen der Brutentnahme infizierter Zellen und dem Vorhandensein steriler und toter Milben zu bewerten. Wir bestimmten das Verhältnis von sterilen und toten Milben (nicht eierablagefähigen Milben), durch den Quotienten aus Anzahl der Puppen mit eierlegenden Milben und Anzahl der Puppen mit nicht eierlegenden Milben. Wir haben diesen Meßwert OVR oder Eiablageverhältnis genannt und dieser Wert kann nur bestimmt werden, wenn man >7Tage nach der Verdecklung der Brutzellen mißt. Ein typischer OVR Wert eines nicht resistenten Stocks ist 6 ( 6 eierlegende Milben auf eine nicht eierlegende Milbe). Resistente Stöcke haben einen OVR zwischen 0 – 1,5.
Bild 1 Nachwuchsverteilung von Milben, die hygienische Entnahme überlebt haben. In jedem Stock, wurde jede übriggebliebene milbeninfizierte Zelle in die 3 genannten Nachwuchsgruppen aufgeteilt. Bei keiner Milbenentnahme würde die Summe der 3 Nachwuchsgruppen (die Summe der Säulen/Gruppe) 100% entsprechen. Der mittlere Punkt der 1. Gruppe (0-19%) hat 10% Entnahme, deshalb wäre die Summe der Säulen 90%. Der mittlere Punkt der letzten Säule (80-99%) ist 90% Entnahme, also ist die Summe der Säulen 10% (90% der infizierten Zellen hat nicht überlebt bzw. wurde ausgeräumt). Diese Grafik zeigt den Zusammenhang zwischen der Entnahmerate von infizierter Brut und dem Milbennachwuchs, der überlebte. 2 Klassen des Milbennachwuchses (lebensfähiger Nachwuchs und nichtlebensfähiger Nachwuchs) nahmen in dem Maße ab, wie die Brutentnahme anstieg, gleichzeitig war keine Änderung der Anzahl der Brutzellen mit Milben ohne Eiablage zu verzeichnen. Jede Gruppe der Säulen repräsentiert den Durchschnitt einer Gruppe von Stöcken, deren Brutentnahmerate ungefähr gleichwertig ist. Es gab 8 Stöcke in der 0-19% Gruppe, keinen Stock in der 20-39% Gruppe und 5, 7 und 6 Stöcke in den jeweils höheren Gruppen. Die im Text zitierte statistische Analyse ging allerdings von den exakten Brutentnahmewerten jedes einzelnen Stockes aus.
Ergebnisse
Bienen mit VSH Eigenschaften entfernen vorzugsweise milbeninfizierte Brutzellen, wenn dieser in der Brut existent sind. Besonders die Brut der Gruppe H hatte eine signifikante Reduktion der Anzahl der infizierten Zellen (Durchschnitt ±STAW = 78±7%) (df=24, t=10.5, P<0.0001). Zufällige Brutentnahme hätte keine Änderung der Infektionsrate zur Folge gehabt. Deshalb wurde Hypothese 1 verworfen. Stöcke der L Gruppe hatten auch eine Abnahme der infizierten Zellen (16±7%), diese war allerdings nicht signifikant verschieden von 0 (df=24, t=1,85, P=0,08). Die beiden Gruppendurchschnitte waren signifikant unterschiedlich (df=1, F=33.7, P<0,0001).
Hypothese 3 wurde verworfen, weil die Überlebensrate der 2 Gruppen eierlegender Milben signifikant abnahm, während die Brutentnahme anstieg (Bild 1). Der Zusammenhang zwischen Brutentnahme und Überleben der lebensfähigen Milben war y=-0.62x + 56, wobei y = die Prozentzahl der überlebenden Milben und x = die Prozentzahl der Brutentnahme infizierter Zellen war (F = 196; df= 1.24; P< 0,0001). Der Zusammenhang war ähnlich für die Gruppe des nichtüberlebensfähiger Milbennachwuchses, y = -0.21x + 20 (F = 42.6; df = 1.24; P<0.0001).
Hypothese 2 wurde verworfen und Hypothese 4 wurde angenommen, weil die “ohne Eier Klasse” hatte einen Anstieg der nicht größer also 0 war, y = -0.05x+15 (F = 2.2;df = 1.24; P < 0.15), und deshalb gab es kein Hinweis auf Entnahme. Die Konstanten (56, 20, und 15%) in diesen Gleichungen schätzen die relative Anwesenheit dieser 3 Milbenklassen in Stöcken, die keine milbeninfizierte Brut entnehmen (Bild 1).
Der Zusammenhang zwischen Brutentnahme und Milben OVR Koeffizient
Es gab eine starke lineare Korrelation zwischen der prozentualen Entnahme von infizierter Brut (x) und dem OVR Koeffizient (y) (y = -0.057x + 5.8) (F = 27; df = 1.24; P < 0.0001; R2 = 0.52). Wenn man davon ausgeht das Hypothese 4 korrekt ist und das 15% der Milben in allen Stöcken keine Eier ablegen, bei keiner Brutentnahme, unser vorausgesagter Zusammenhang wäre y = -0.067x + 5.7. Die Konstante oder Nullpunkt ist der OVR Koeffizient (85/15), wenn die Entnahme (x) = 0. Wenn x = 85 (alle eierablegenden Milben ausgeräumt), geht der OVR gegen 0. Deswegen ist der vorhergesagte Anstieg (b) = -0.067. Sowohl Anstiegt als auch der y- Achsenschnittpunkt des vorhergesagten Graphen sind innerhalb der errechneten Standardfehler der Daten (Standardfehler für Anstieg und Schnittpunkt sind ± 0.011 und ± 0.7). Weil der Zusammenhang zwischen Brutentnahme und OVR Koeffizient so klar zusammenhängt, ist unsere Schlußfolgerung, das man VSH sowohl über Brutentnahme als auch über den OVR bestimmen kann.
Das Entfernen von infizierten Puppen und das nicht Entfernen von Puppen mit Milben, die keine Eier legen, sind die bestimmenden Merkmale von VSH. Wie oben beschrieben sind diese Merkmale bei Kolonien mit VSH Verhalten vorhanden. Aber, diese Merkmale könnten nicht vorhanden sein, wenn man nur auf hygienisches Verhalten in Bezug auf Milben selektiert/züchtet. Um beide Merkmale zu erzeugen, könnte es notwendig sein, die gerichtete Züchtung an OVR (ovipositioning ratio – Quotient aus der Anzahl von infizierten Puppen mit eierlegenden Milben durch die Anzahl der Puppen mit nicht eierlegenden Milben). Glücklicherweise ist es einfacher das OVR zu messen als die Entnahme der Brut (eine versus zwei Messungen) und vielleicht sogar genauer (eine Meßungenauigkeit versus zwei). Unglücklicherweise sind Milben, die keine Eier legen oder tote Milben leichter zu übersehen, wenn man die Brut untersucht.
Das Vorhandensein von VSH kann man am besten selektieren, wenn man Völker hat, die ein OVR Verhältnis von 2 oder weniger haben. Völker, die einen OVR > 3 haben sind zur Bestimmung von VSH ungeeignet, da das natürliche Vorkommen von VSH im OVR Bereich von 4-10 und gar noch geringer liegt. In dieser Arbeit waren die 14 Kolonien der H Gruppe bei einem OVR von 0-1,4. Die L Gruppe hatte OVR’s von 3,3-9,5 und 8 der 12 Kolonien hatte keine messbare VSH in Form von Entnahme infizierter Brut oder kleinem OVR.
Es scheint deshalb das Bienen mit 50-100% VSH Allelen signifikante Milbenresistenz aufweisen, aber Bienen mit 0-50% VSH eben nicht. Das erklärt, warum wir eine merkbare Anzahl milbenresistenter Völker erzeugt haben, als wir VSH Königinnen mit unselektierten Drohnen frei gepaart haben (Harbo …).
Diese Arbeit hat nicht das Schicksal der Milben untersucht, deren Reproduktionszyklus unterbrochen wurde. Die Langlebigkeit und Fruchtbarkeit von Milben könnte durch diese Unterbrechungen beeinflusst sein und in früheren Studien haben wir gezeigt, das es viele Milben gab, die quasi zwischen Zellwand (der Wabenzelle) und dem Kokon (der Puppe) gefangen waren (Harbo..). Ibrahim und Spivak fanden, das Milben aus VSH Völkern eine höheren Anteil hatten, die keine Eier legten, verglichen mit einer Milbenpopulation aus Kontrollvölkern. Deshalb könnte die Unterbrechung der Reproduktionsphase der Milben in der Brutzelle (z.B. durch VSH) zur Beeinträchtigung der Milbenreproduktion oder gar zum Tode der Milbe führen, falls diese wieder eine Brutzelle aufsucht.
Falls die Bienen mit VSH nur die infizierten Puppen mit eierlegenden Milben ausräumen, dann reagieren sie direkt oder indirekt auf Eier oder eierlegende Milben. Indirekte Reaktionen könnten z.B. sein, das erwachsene Bienen chemische oder verhaltensaufällige Hinweise von eierlegende Milben erkennen können, wie Jungmilben oder gestresste Puppen (Boecking….) oder Veränderungen des Verdecklungsprofils der befallenen Puppe (Salvy…).